干貨分享--WB實驗問題總結與處理方案（三）

41、跑電泳的時候配的膠總是“縮"是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。

42、蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE， 濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和PVDF膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的PVDF膜（0.2微米）。

44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。

45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？

答：半定量實驗需要有內參。

46、核內抗原Western Blot內參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。

47、做半定量Western Blot，內參β-actin，GAPDH哪個好？

答：兩者均可。

48、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？

答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。

49、轉膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉"，其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調節pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4度過夜。

51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：

（1）電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55v，分離膠75v就能跑得很好。

（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

53、為什么提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。

54．電泳中常出現的一些現象：

●︶ 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統溫度偏高。

●︵ 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不*。

●拖尾

原因：樣品溶解不好。

●紋理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒。

●條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

●條帶兩邊擴散

原因：加樣量過多。

55．Western blot結果中背景較高

可能的原因及建議：

●膜封閉不夠

延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。

●一抗稀釋度不適宜

對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。

●一抗孵育的溫度偏高

建議4℃結合過夜。

●選擇的膜容易產生高背景

一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低。

●膜在實驗過程中干過

實驗過程中要注意保持膜的濕潤。

●檢測時曝光時間過長

減少曝光時間。

56．Western blot結果中雜帶較多

可能的原因及建議：

●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶。

查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查閱文獻或生物信息學分析可能性。

●樣本處理過程中目的蛋白發生降解

加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。

●上樣量過高，太敏感

適當減少上樣量。

●一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體。

●一抗不純

純化抗體

●一抗或者二抗濃度偏高

降低抗體濃度。

57 . Western blot結果中無信號或顯示信號弱

可能的原因及建議：

●檢測樣本不表達目的蛋白

選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性。

●檢測樣本低表達目的蛋白

提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

●轉移不*或過轉移

可以用麗春紅染膜并結合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。

●抗體不能識別測試種屬的相關蛋白

購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。

●一抗孵育時間不足

建議4℃結合過夜。

●二抗與一抗不匹配

選擇針對一抗來源的種屬的抗體。

●洗膜過度

洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

58. 其它現象：

●膜上多處出現黑點或黑斑

原因：抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。

●反白（條帶顯白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

59．安全問題：

操作有毒試劑時，帶手套，且操作揮發性試劑應在通風櫥中進行。