逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR，rtpcr）

RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

基本原理：

用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成與其互補(bǔ)的DNA（cDNA）的過程。因?yàn)?/span>mRNA末端存在Poly A，所以用Oligo dT作為通用引物與其互補(bǔ)。商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒里通常除了Oligo dT之外，還可以用隨機(jī)引物，但一般用Oligo dT引物就可以了。

重要參數(shù)：

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同；因此，適合于一種mRNA拷貝的條件可能對(duì)另一種mRNA不適合。一般來說，從事不均一mRMA群體時(shí)，所使用的條件是導(dǎo)致cDNA合成的終產(chǎn)量達(dá)到最大，下述參數(shù)十分重要。

1、逆轉(zhuǎn)錄酶： 有兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化以mRNA為模板，oligo(dT)作為引物，合成與mRNA互補(bǔ)的cDNA鏈。一種來自純化的 AMV，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNA酶H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另外，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內(nèi)切酶污染。

另一種是Mo-MLV，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對(duì)較弱的RNA酶H活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNA酶H活性對(duì)獲得2-3kb的mRNA的全長(zhǎng)cDNA有很大好處。在第一鏈反應(yīng)前可用氫氧化甲基汞處理，破壞mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這一步對(duì)于最適反應(yīng)溫度較低(37)℃的鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑，可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。

2、單價(jià)陽(yáng)離子： 離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對(duì)于cDNA長(zhǎng)度的最適鉀離子濃度為140-150mM。

3、二價(jià)陽(yáng)離子： 對(duì)于反轉(zhuǎn)錄酶活性來說，二價(jià)陽(yáng)離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性；產(chǎn)生全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的最適濃度是6-10mM。

4、脫氧核苷三磷酸： 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對(duì)于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。

注意事項(xiàng)：

1、RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；

2、RNA 提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的RNA很容易降解；

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無(wú)RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。